Проекты

Успешно завершен проект РНФ № 15-18-00258 «E. coli как мишень терапии при болезни Крона». За это время проведено полногеномное секвенирование 10 штаммов E. coli, высеянных из кишечника больных с обострением болезни Крона и биоинформатический сравнительный анализ геномов полученных штаммов с геномами других БК-ассоциированных штаммов (всего 27 штаммов) и с геномами симбионтных штаммов (24 штамма). Выявлен ряд генов, достоверно чаще встречающихся у БК-изолятов [Rakitina D.V. et al., Genome analysis of E. coli isolated from Crohn's disease patients. BMC Genomics. 2017,18(1):544; Tyakht A.V. et al., Genetic diversity of Escherichia coli in gut microbiota of patients with Crohn's disease discovered using metagenomic and genomic analyses. BMC Genomics. 2018, 27;19(1):968.], методом люминол-зависимого хемилюминесцентного ответа исследована способность БК-изолятов активировать нейтрофилы и нейтрализовать продуцируемые ими активные формы кислорода [Moshkovskaya M. et al. Neutrophil activation by Escherichia coli isolates from human intestine: effects of bacterial hydroperoxidase activity and surface hydrophobicity. FEBS Open Bio. 2020, 10(3):414-426], проведен сравнительный анализ адгезивно-инвазивной активности лабораторных штаммов E. coli, БК-изолятов и изолятов от здоровых людей, показано, что БК-изоляты имеют адгезивно-инвазивный фенотип, проведен протеомный ВЭЖХ-МС анализ белков плазмы крови человека после ее инкубации с БК-изолятами в присутствии и отсутствие муцина. Предполагается, что связавшие муцин клетки бактерий теряют способность взаимодействовать с IgG, белками комплемента и некоторыми другими белками. Определены белки внешней мембраны E.coli, способные связывать муцин [Mikhalchik E.V. et al., Mucin adsorbed by E. coli can affect neutrophil activation in vitro.FEBS Open Bio. 2019, 30;10(2):180-96], разработаны 4 системы количественной ПЦР, стабильно и специфично детектирующие гены, специфичные для БК- изолятов (pduC, ccmk2_1, ccmL и pduU), проведен анализ вирулентных свойств для трех наиболее активных БК-изолятов в зависимости от источника углерода при культивировании, определено, что пассирование на пропионате натрия активирует, а пассирование на глюкозе значительно снижает способность к адгезии, инвазии и выживаемости в макрофагах. Сравнение двух противоположных по активности состояний на уровне протеома и транскриптома для каждого изолята позволили получить целый спектр регуляторных событий, а также отдельных генов и соответствующих им белков, участвующих в переходе к адгезивно-инвазивному фенотипу [Pobeguts, O.V. et al., Propionate Induces Virulent Properties of Crohn's Disease-Associated Escherichia coli. Front Microbiol. 2020, 11:1460 ].

Проект посвящен изучению микроколоний Mycoplasma hominis, обладающих чрезвычайной устойчивостью к неблагоприятным факторам. Ранее считали, что Mycoplasma hominis является условным патогеном человека, способным вызывать только острые и хронические инфекции урогенитального тракта. Однако в настоящее время показано, что она может инфицировать другие органы и ткани, колонизировать раковые клетки и модулировать их развитие, адгезироваться на поверхности клеток крови и с током крови разноситься по органам и тканям, вызывая генерализованную микоплазменную инфекцию. И.В. Раковской с соавторами из крови пациентов с различными патологическими процессами культуральным методом была получена новая форма M.hominis (УМФ), отличающаяся от классической формы (КФ) морфологией, очень маленьким размером колоний, медленной скоростью роста и при этом обладающая удивительной устойчивостью к различным неблагоприятным факторам. Протеомный анализ показал, что в клетках, формирующих УМФ, происходит переключение метаболизма в сторону утилизации не аргинина, а нуклеозидов пиримидинового ряда, в частности тимидина. Это приводит к замедлению основных клеточных процессов, клетки переходят в состояние, подобное персистерам. Проведено профилирование липидного состава мембраны КФ и УМФ M. hominis и реконструирован метаболизм липидов. Секвенированы геномы лабораторного штамма M. hominis H-34 в двух формах, КФ и УМФ, на приборе MiSeq (Illumina) с парноконцевыми прочтениями 2*250, а также на платформе MinION (Oxford Nanopore Technologies), проведен поиск однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) между собранными геномами. В результате мы обнаружили 17 ОНП, больше половины из которых содержались в генах мембранных липопротеинов. Сравнительный анализ адгезивно-инвазивного потенциала КФ и УМФ M. hominis на модели заражения эукариотической линии HeLa показал, что клетки КФ после инфекции дают значительно изменяются размер и морфология колоний, а также наблюдается появление мини колоний. Протеомное профилирование 9 клинических изолятов и лабораторного штамма Н-34 M. hominis методом ВЭЖХ-МС, определены функциональные изменения, характерные для клинических изолятов. С помощью транспозонного вектора получены мутанты M. hominis со сверхэкспрессией генов deoA, кодирующего тимидинфосфорилазу, ack, кодирующего ацетаткиназу и mMaple, кодирующего флуоресцентный белок. С помощью системы на основе CRISPR-интерференции был получен мутант M. hominis, с репрессированной экспрессией гена deoA. С помощью этих мутантов подтверждена роль тимидинфосфорилазы в метаболизме M. hominis. В итоге построена модель изменяющихся путей метаболизма M. hominis, в которой кроме уже известных путей энергетического метаболизма, а именно аргинин-дигидролазного и пентозо-фосфатного, существует еще один способ добычи энергии - путь утилизации фосфорилированных пентоз, образующихся при деградации нуклеозидов. Эта теория, разработанная на модели лабораторного штамма, подтверждается и с помощью генно-инженерных мутантов лабораторного штамма, и находится в согласии с данными, полученными для клинических